聚乙烯亚胺PEI-Pro(GMP)的操作与维护指南

　　聚乙烯亚胺PEI-Pro（GMP）是一种GMP级别的转染试剂，其操作与维护指南主要包括以下内容：

　　一、操作指南

　　1.贴壁细胞转染操作

　　以6孔板转染293T细胞为例：

　　转染前准备：

　　转染前一天：用胶原酶消化细胞并计数（不建议用胰酶）。按照每孔2×10^6的细胞量接种293T至6孔板（每孔加入2ml新鲜的DMEM:F12+5%FBS培养基和1ml的细胞悬液），置于37°C、5%CO2培养箱培养24小时。

　　24小时后，移除之前培养基，每孔加入2ml新鲜的DMEM:F12+5%FBS。注意确保293T细胞生长状态良好，传代不超过15代。

　　第一天：显微镜下检查细胞汇合度，当细胞达到70%到80%的汇合度时，开始准备转染。

　　转染步骤：

　　对于每孔细胞，用100μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释DNA，使DNA终浓度为1ug/ml（DNA/总培养体积）。

　　对于每孔细胞，用100μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释适当比例的适量BIOHUB-PRO GMP。DNA与BIOHUB-PRO GMP的比例要根据实验摸索最适比例。

　　将稀释的BIOHUB-PRO GMP转染试剂加入到稀释的质粒中（总体积200μL），轻轻混匀，室温孵育30分钟。

　　小心地将BIOHUB-PRO GMP复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻轻摇动培养板混匀。注意加入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入，避免破坏细胞的粘附性。

　　将培养板放入37°C、5%CO2培养箱中培养24小时。

　　观察转染结果：

　　第二天：在荧光显微镜下观察细胞转染效率，通常超过80%的293T细胞在转染后的24小时可以观察到绿色荧光。

　　2.悬浮细胞转染操作

　　以293F细胞于100mL培养瓶（溶液体积占瓶体积的1/5）操作体系为例：

　　细胞培养：

　　HEK293F细胞传代接种于20mL悬浮细胞生长培养基中，在36.5℃、120rpm、5%CO2的条件下培养。当细胞密度达到1×10^6cells/mL时，旋紧瓶口放入摇床继续培养，2~4小时后可以进行转染。

　　转染步骤：

　　用1mlOptiPRO?SFM（无血清培养基）稀释适量的DNA，使DNA终浓度为1ug/ml（DNA/总培养体积）。混匀并静置5分钟。

　　用1mlOptiPRO?SFM（无血清培养基）稀释适当比例的BIOHUB-PRO GMP，混匀并静置10分钟。

　　将BIOHUB-PRO GMP转染试剂加入到稀释的质粒中，轻轻混匀，室温孵育30分钟。

　　将BIOHUB-PRO GMP转染复合物逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床（36.5℃、5%CO2、120rpm）。

　　基因表达检测：

　　基因表达可在24~72小时后检测，具体时间取决于细胞系和转基因。
 

　　二、维护指南

　　1.储存条件

　　PEI-Pro（GMP）转染试剂建议储存在低温环境中，如4℃冰箱或-20℃冰冻条件下。低温环境能够有效延缓PEI分子结构的降解，保持其稳定性。

　　避免PEI溶液的反复冻融，以保持其最佳状态。

　　2.使用注意事项

　　PEI-Pro（GMP）转染试剂的使用浓度是实验效果的关键因素之一。一般建议将PEI溶液稀释至适合的工作浓度后立即使用，避免长时间储存稀释后的溶液。

　　不同的细胞类型对PEI浓度的敏感度不同，实验人员应根据具体细胞的需求进行优化，以提高转染效率。

　　若发现PEI溶液出现沉淀、浑浊或颜色变化，可能意味着其已发生降解，建议此时更换新的试剂，以确保实验结果的准确性。

　　3.定期验证

　　长期保存的PEI-Pro（GMP）转染试剂在使用前应进行小规模实验验证其转染效率是否依然符合要求，这样可以避免浪费实验材料和时间。

　　4.更新与替换

　　对于经常需要使用PEI-Pro（GMP）转染试剂的实验室，建议定期更新储存的试剂，并按照生产商的建议进行正确的储存和使用。

　　通过以上操作与维护指南，可以确保聚乙烯亚胺PEI-Pro（GMP）转染试剂在细胞转染实验中的有效性和稳定性，提高实验结果的准确性和可重复性。